La funzione della distrofina

a cura di Antonella Pini

Nel corso di un meeting organizzato e sponsorizzato dalla UILDM di Bologna e dalla Regione Emilia Romagna, sono state presentate in febbraio a Bologna le finalità e i risultati preliminari di un progetto di ricerca finanziato dall'Unione Europea davvero promettente. Si tratta di Finger (Functional Analysis of Introns and Gene Regulatory Sequences) che punta letteralmente "il dito" (in inglese finger significa "dito") sullo studio funzionale degli introni e delle sequenze regolatrici geniche, allo scopo di poter agire specificatamente sull'espressione genica.

Ci pare molto importante darne comunicazione in questa sede perché si tratta di un progetto di ricerca strutturato in maniera tale da riguardare molto da vicino sia il gene della distrofina e il suo prodotto, sia il paziente affetto da distrofia. Infatti, i ricercatori coinvolti nel progetto (Tomaso Patarnello, Padova; Johan Dendunnen, Leiden; Ian Eperon, Leicester; Francesco Muntoni, Londra), coordinato da Alessandra Ferlini, responsabile del Laboratorio di Genetica Molecolare della Sezione di Genetica Medica dell'Università di Ferrara, stanno cercando di capire fino in fondo come funzioni il gene della distrofina, se ci siano e quali siano le parti di DNA limitrofe non codificanti (introni) che ne regolano l'espressione e quali siano i rapporti precisi tra anomalia genetica, anomalia proteica e problemi clinici.

Ci sono infatti, come noto, pazienti con caratteristiche cliniche (fenotipo clinico) gravi, tipo Duchenne, che hanno differenti anomalie genetiche (mutazioni) o che non ne mostrano affatto, almeno nelle regioni cosiddette codificanti, quelle cioè routinariamente esplorate nella diagnostica molecolare o che hanno mutazioni atipiche. Altri pazienti hanno fenotipi clinici di assai più modesta gravità, pur mostrando le medesime mutazioni dei fenotipi più gravi. Queste correlazioni apparentemente inspiegabili sono probabilmente dovute a parti del gene con funzione non direttamente codificante bensì regolante l'espressione. Il comprendere a fondo tali meccanismi biologici dovrà avere importanti conseguenze sul piano non solo della diagnosi, ma anche della prognosi e delle possibili strategie terapeutiche future.

Il progetto - iniziato nel 2000 e la cui conclusione è prevista nel 2003 - si compone di diverse fasi: 1) selezione di pazienti con fenotipo clinico ed espressione della distrofina muscolare ben definiti; 2) caratterizzazione del loro corredo genetico e dell'RNA; 3) definizione dell'assetto della distrofina nei pazienti studiati; 4) identificazione di sequenze introniche con possibile funzione regolatrice e loro analisi filogenetica; 5) studi funzionali.

E' la stessa coordinatrice, Alessandra Ferlini, a rispondere ad alcune nostre domande.

C'è ancora molto da capire sulle basi patogenetiche delle distrofinopatie?

Sì. Basti pensare che il gene della distrofina è il più grande gene umano conosciuto e che il 99,5% delle regioni del gene non vengono normalmente esplorate. Inoltre gli introni, pur non essendo codificanti per la proteina, non sono affatto inutili. Essi sono coinvolti nella quasi totalità delle mutazioni e alcuni di essi hanno probabilmente la funzione di regolare l'espressione del gene.

Ma cosa sono esattamente gli introni e che cos'è lo splicing?

Gli introni sono sequenze di DNA che non partecipano alla codifica della proteina, ma che fanno ugualmente parte della sequenza specifica di un determinato gene, come appunto la distrofina; essi inizialmente vengono trascritti in RNA, ma poi vengono rimossi con un processo molto importante, denominato splicing, il quale ha luogo prima che l'RNA venga tradotto in proteina. Dunque gli introni non sono presenti nell'RNA messaggero maturo che è la sequenza di base da cui deriva poi il processo di traduzione e quindi di formazione della proteina.

A cosa serve studiare l'RNA?

L'RNA è una sorta di ponte fra DNA e proteina. Avere quindi un quadro dell'RNA prodotto da un DNA stampo come la distrofina, in presenza di mutazioni che determinano un fenotipo patologico, fornisce informazioni preziose sul processo detto patogenesi, cioè di come da un fattore eziologico (la mutazione) si arrivi ad un fenotipo specifico.

Si può modulare l'espressione di un gene?

Teoricamente è possibile, molti lavori pubblicati hanno riportato infatti approcci assai interessanti e promettenti, almeno in sistemi funzionali. Il problema iniziale è però quello di identificare le sequenze che hanno di fatto un ruolo nel modulare l'espressione genica (cosa non facile di per sé) e in seguito occorre valutare in quale modo possa essere possibile interagire con queste sequenze in modo efficace, ma allo stesso tempo specifico. Voglio dire che la modulazione deve riguardare espressamente la regione cosiddetta target che si vuole regolare, e non possa avere invece un effetto a tappeto che potrebbe coinvolgere molteplici sequenze con potenziali effetti anche molto negativi. Questo può essere un problema molto rilevante e difficile da risolvere.

A cosa serve caratterizzare precisamente il DNA e l'RNA?

Questa rappresenta certamente una delle fasi più impegnative del progetto. La caratterizzazione molecolare dovrà essere molto più "fine" e precisa di quella routinaria ai fini solo diagnostici. Da questa fase ci si attende la precisa configurazione dei genotipi distrofina in circa cinquanta pazienti altamente informativi secondo i criteri descritti. La conoscenza a livello nucleotidico delle mutazioni in questi pazienti consentirà una sorta di mappa geografica delle regioni del gene distrofina che potrebbero essere coinvolte nel modulare l'espressione clinica delle mutazioni nel gene stesso.

Quali informazioni può dare lo studio approfondito della distrofina nei pazienti affetti da distrofinopatia?

In questa fase l'aspetto proteico verrà messo in relazione con i dati molecolari e il fenotipo clinico. Questa correlazione è molto importante perché da essa ci si aspetta una risposta alla domanda "quanta distrofina è necessaria per evitare la patologia a carico della muscolatura sia scheletrica che cardiaca?". Tale risposta potrà servire anche ad impostare un corretto approccio di terapia genica, tale da far produrre ai tessuti-bersaglio la quantità minima ma efficace di proteina.

Che cosa vi aspettate dagli studi funzionali?

Tutti questi studi sono tesi a dimostrare quali sequenze fra quelle identificate abbiano un reale ruolo nella regolazione dell'espressione genica. Tali studi saranno particolarmente focalizzati sulle regioni promotrici del gene e sulle sequenze che regolano lo splicing. Le eventuali sequenze regolative identificate verranno modulate con una tecnica definita approccio con oligonucleotidi antisenso, nota per la sua capacità di interagire con molecole di RNA e di conseguenza modularne gli effetti. Vorrei sottolineare che tutti gli studi funzionali da noi programmati avverranno ovviamente in sistemi di studio cosiddetti "in vitro" (senza supporto cellulare) o "in vivo" (su cellule coltivate).

Quali sono i risultati preliminari del vostro studio ?

Al momento (stiamo entrando nel terzo anno del progetto) abbiamo già identificato alcune regioni introniche che hanno un sicuro ruolo nel modulare il processo dello splicing della distrofina. Su queste regioni sono in corso studi funzionali che cercheranno appunto di testare la loro modulabilità, utilizzando oligonucleotidi antisenso. Altre regioni sono in corso di studio e per esse sia l'analisi filogenetica che quella funzionale saranno in grado di precisarne il ruolo funzionale. Abbiamo inoltre evidenze preliminari ma molto confortanti che suggeriscono come almeno in alcuni casi il processo di splicing giochi un ruolo fondamentale nel determinare il fenotipo clinico, cioè nel causare forme molto lievi (tipo forma ad esordio molto tardivo paucisintomatica) o forme di distrofinopatia grave con cardiomiopatia isolata o tipo Duchenne-Becker.

Il progetto in corso sul gene distrofina potrebbe trovare applicazioni di studio in altre malattie ereditarie?

Sì, noi pensiamo che, come per altri importanti aspetti funzionali, il gene distrofina rappresenti di fatto una sorta di modello che se opportunamente studiato potrà fornire importanti indicazioni per studiare aspetti funzionali di altri geni e per impostare strategie mirate all'identificazione di sequenze genomiche che regolano l'espressione genica.

Articolo tratto da DM 145 - aprile 2002. DM è un trimestrale edito dalla Direzione Nazionale dell'Unione Italiana Lotta alla Distrofia Muscolare. La Redazione di DM ha sede in: Via P.P. Vergerio, 19 - 35126 Padova, Tel. (049) 8025248 - Fax (049) 8025249 e-mail: redazionedm@eosservice.com