Va componendosi il puzzle!

Intervista a Giulio Cossu

Nel mese di luglio 2003 un importante risultato nella lotta alle distrofie muscolari è stato annunciato da Giulio Cossu, direttore del Centro per le Cellule Staminali dell'Istituto San Raffaele di Milano. Per la prima volta, infatti, si è dimostrata efficace una terapia cellulare applicata su un modello animale affetto da una distrofia dei cingoli di tipo 2D. Il lavoro, frutto anche del grande sforzo di finanziamento di Telethon, è stato ripreso dalla prestigiosa rivista internazionale "Science", che ne ha pubblicato i risultati sotto forma di research article: un altro preciso segnale, questo, che ci troviamo realmente di fronte a qualcosa di importante.

Per capire la sostanza e il significato della scoperta, oltre che per sapere meglio cosa potremo aspettarci nel futuro - a breve e lunga scadenza - abbiamo parlato direttamente con Giulio Cossu, qualche mese dopo la presentazione ufficiale dei risultati.

(Stefano Borgato)

Ci può spiegare, professor Cossu, in che cosa consiste esattamente la ricerca presentata nel luglio scorso presso l'Istituto Scientifico San Raffaele di Milano, che tanto ha fatto parlare?

Si è trattato di uno studio di due anni realizzato con l'obiettivo di rimpiazzare le fibre muscolari di un topo affetto da distrofia, con un nuovo tipo di cellule staminali precedentemente isolate dai vasi sanguigni e cresciute in coltura, che abbiamo chiamato mesoangioblasti. Il modello scelto è stato il topo knock-out, affetto da una forma di distrofia dei cingoli per mancanza di alfa-sarcoglicano, nel quale - con una modificazione genetica - è stato rimosso il gene che codifica per una delle proteine che si associano alla distrofina, formando quel complesso che lega il citoscheletro della fibra muscolare alla matrice e in qualche modo rinforza la membrana della fibra stessa durante la contrazione. In assenza di questa proteina, nemmeno le altre del complesso riescono a rimanere associate e quindi la membrana diventa più fragile e più suscettibile a rottura durante la contrazione.

Il motivo per cui abbiamo scelto questo topo invece del convenzionale topo mdx - modello della distrofia di Duchenne - è che in questo animale, al contrario che nell'uomo, la mancanza di sarcoglicano porta a conseguenze più severe. Abbiamo pensato, quindi, che partendo da un modello più grave sarebbe stato più facile vedere dei miglioramenti anche funzionali.

Ma in che cosa è consistito esattamente il protocollo sperimentale?

Nell'iniettare mezzo milione di mesoangioblasti provenienti da un topo normale nell'arteria femorale del topo distrofico. Noi sapevamo in precedenza che queste cellule possono essere cresciute in coltura, che possono differenziare in fibre muscolari (in presenza di altre cellule che stiano anch'esse formando fibre muscolari) e pensavamo - anche se all'epoca l'evidenza non era solida com'è oggi - che potessero aderire all'endotelio di un tessuto dove c'è un'infiammazione in corso, come nella distrofia, e attraversarlo, passando nei muscoli. Questo è importante, pensando ad esempio che i mioblasti usati in precedenza non hanno questa capacità.

Restando ai mioblasti, va ricordato come da vent'anni i neurologi cerchino in tutti i modi di fare arrivare queste cellule nei siti dove il muscolo si sta rigenerando. Ma questo non è successo per il semplice motivo che i mioblasti, una volta iniettati intramuscolo, non migrano per più di 1 o 2 millimetri dal sito dell'iniezione, e siccome i muscoli scheletrici rappresentano una massa enorme dei tessuti del nostro corpo, il tutto diventa ben difficilmente praticabile. Ci vorrebbero milioni di singole iniezioni per raggiungere ogni millimetro cubo dei muscoli del nostro organismo! Viceversa, l'albero vascolare arterioso porta le cellule - così come ogni altra sostanza - esattamente nei muscoli che vengono irrorati da tali arteriole. Abbiamo perciò sfruttato questa facoltà dei mesoangioblasti di circolare, di aderire alla parete e poi di passare nei muscoli. E difatti già pochi giorni dopo abbiamo visto che si distribuivano nell'interstizio, cioè nello spazio che c'è nel muscolo tra fibra e fibra, ma - ciò che è più importante - contribuendo anche alla formazione di nuove fibre muscolari. Le cellule erano marcate (con coloranti o altri sistemi che consentissero di individuarle) e questo ci ha permesso appunto di vedere che quelle fibre formate esprimevano il sarcoglicano, ottenendo la prova funzionale che i mesoangioblasti avevano partecipato alla formazione di nuovo muscolo e avevano contribuito a queste nuove fibre il gene che mancava nella malattia originaria.

Il successivo protocollo, fatto di tre iniezioni consecutive a distanza di un mese l'una dall'altra, ha portato alla ricostituzione di fibre apparentemente normali fino al 40, 50% (in qualche caso anche il 60%), ovvero la base per un recupero funzionale della motilità. Non solo nella gabbia i topi si muovevano di più, ma anche messi su una ruota che girava, sono riusciti a rimanere in equilibrio per un tempo sempre inferiore a quello dei topi normali, ma enormemente superiore a quello dei topi distrofici non curati.

Va detto tra l'altro che le tre iniezioni consecutive a distanza di un mese sono state dettate dalle piccole dimensioni del modello animale. In altre parole, se nel topo ogni iniezione intrarteriosa può essere considerata un piccolo intervento chirurgico, non così sarebbe in futuro per l'uomo, dove tale pratica potrebbe davvero diventare molto semplice.

Si può dire, in sostanza, che siamo in presenza del primo effettivo ed efficace risultato di una terapia cellulare applicata su un modello animale affetto da una forma di distrofia?

Certamente. Il risultato ottenuto è stato la prima reale dimostrazione di un recupero funzionale dei muscoli trattati con questo tipo di cellule staminali.

Ma non solo, la seconda parte del lavoro, infatti, è consistita nel vedere se si poteva associare un protocollo di terapia genica a quello di terapia cellulare, per cui sempre i mesangioblasti sono stati isolati questa volta da un topo malato cui mancava il sarcoglicano. Abbiamo prodotto un vettore virale che codificasse il sarcoglicano, infettando successivamente le cellule durante la loro crescita in coltura. Dopo aver verificato che queste producessero effettivamente sarcoglicano, le abbiamo iniettate nello stesso modo che avevamo usato per le cellule normali. Ebbene, anche in questo caso le cellule si sono distribuite nei muscoli, hanno contribuito a produrre nuovo sarcoglicano nelle fibre che si andavano formando e hanno dato un recupero morfologico e funzionale del muscolo trattato.

Quindi, anche da questo punto di vista i risultati sono stati un successo, superiore - a dir la verità - alle nostre più rosee aspettative.

Crediamo sia giusto puntualizzare che il passo avanti nella conoscenza scientifica e nella lotta alle distrofie muscolari c'è ed è reale, ma che ancora non si può parlare di una terapia. E' giusto dire questo?

Sicuramente, anche perché - come potrete immaginare - riceviamo comunque numerose lettere, telefonate e messaggi da pazienti di tutto il mondo i quali chiedono notizie sulla nostra ricerca e si offrono per una prova clinica quand'essa fosse disponibile. Bisogna quindi sapere che questo è un risultato notevole, un passo importante in una strada che però è ancora lunga, perché ci sono vari problemi molto grandi ancora da affrontare e da risolvere.

Il primo è quello che un uomo ha dei muscoli di gran lunga più grandi di quelli di un topo e quindi, per poter ricostituire l'intera massa di un quadricipite umano non servirà più mezzo milione di cellule, ma probabilmente ne servirà un miliardo! In questo senso, noi non siamo ancora in grado di crescere le equivalenti cellule umane, soprattutto se prelevate dai pazienti, fino a raggiungere quei numeri. E' proprio a tale scopo che stiamo studiando i mesoangioblasti umani, ma non conosciamo ancora di queste cellule le stesse cose che abbiamo imparato su quelle del topo: e potremmo avere delle brutte sorprese, come ad esempio che le cellule umane non crescano tanto quanto quelle murine. Potremmo quindi averne poi in numero insufficiente.

Immaginiamo che si presentino anche dei problemi immunologici...

Sì, perché mentre i topi sono tutti immunologicamente identici - come fossero dei gemelli monocoriali - non è così per gli uomini. Abbiamo quindi di fronte due prospettive. La prima è quella di usare delle cellule da un donatore, mettendoci quindi nelle medesime condizioni di ciò che accade in un trapianto d'organo, con la necessità di un'immunosoppressione che dovrebbe cominciare a tre anni di vita e durare per tutta l'esistenza. Una situazione, questa, non certo accettabile, ammesso e non concesso che dimostrassimo di poter ottenere mesoangioblasti da donatori immunocompatibili.

L'altra possibilità è quella di prendere le cellule del paziente, riuscire a crescerle in numero sufficiente - ciò che è ancora da dimostrare - e poi trasferire nelle stesse la copia sana del gene che manca. Com'è noto, nel caso della distrofina il gene è troppo grande per entrare in un vettore virale e stiamo quindi provando, in collaborazione con Jeff Chamberlain della Washington University negli Stati Uniti, ad usare dei vettori virali in cui quel ricercatore ha clonato la cosiddetta microdistrofina, una distrofina molto piccola, che manca di quasi tutta la parte centrale, ma che nei topi transgenici sembra funzionare bene quasi quanto la distrofina.

Fin qui è stato il vettore lentivirale a funzionare meglio con i mesoangioblasti, ovvero quello derivato dal virus dell'AIDS e al momento si sta lavorando a fondo proprio per rendere tale tipo di vettore sicuro ed efficace per la terapia dei pazienti. Un lavoro - va precisato - che non seguiamo noi, ma del quale pensiamo, e speriamo, di poter beneficiare nel giro di due, tre anni.

Quindi, o si trova un modo per non immunosopprimere tutto il sistema, mirato cioè alla tollerizzazione specifica, che induca una tolleranza selettiva - strada che potrebbe essere accettabile - oppure bisogna guardare al nostro impegno che continua su tutti i fronti, per ottenere le cellule umane. In questo ambito speriamo di beneficiare dei risultati che i ricercatori che lavorano sui vettori virali avranno nel frattempo ottenuto, per arrivare a dei vettori lentivirali efficaci e sicuri.

Molte speranze, in conclusione, ma ancora parecchi passi da fare prima di poter arrivare ad un tentativo terapeutico sull'uomo che possa avere una speranza di successo.

Al di là della particolare forma di distrofia interessata dallo studio (una cingoli di tipo 2D, come accennato), come possiamo spiegare ai lettori che anche le altre forme di malattie neuromuscolari (nel caso che le terapie funzionino) potranno essere tutte coinvolte e trarne dei risultati positivi?

E' molto importante essere chiari su questo punto. Concettualmente l'approccio che noi abbiamo usato potrebbe andar bene per tutte le distrofie muscolari primitive note al momento, in cui il danno sia causato da una mutazione a carico di un gene che non fa sintetizzare una specifica proteina e che può essere sostituito (come le distrofinopatie o le sarcoglicanopatie). Non certo per la distrofia miotonica di Steinert, ad esempio, dal meccanismo più complicato, non per le malattie ove il danno è neurale (come le amiotrofie spinali) o per quelle di tipo autoimmune (come la miastenia grave).

In ogni caso vorrei aggiungere una rapida annotazione personale: è da trent'anni che lavoro per trovare una terapia utile contro le distrofie muscolari ed è stata una strada lunga, cosparsa anche di numerosi fallimenti. Questa volta abbiamo avuto un po' di intuito e molta fortuna e un primo, importante risultato è arrivato. Ora sono in corso altri esperimenti su animali e il lavoro continua, per cercare di trovare i vari pezzi mancanti del "puzzle", in modo tale da evitare "salti nel buio", come è già successo in passato (si pensi al trapianto dei mioblasti, che sembrava ad un passo dall'essere la "soluzione", ma non lo è stato).

Ci sembra anche di capire che il contributo di Telethon - che ha finanziato il gruppo di lavoro con oltre 800mila euro nel corso degli anni e che ha già stanziato un altro milione e 300mila euro per il prossimo triennio - sia stato particolarmente importante. Cosa ci può dire a tal proposito?

E' stato un contributo fondamentale. Tutta questa vicenda era completamente ferma finché non è arrivato Telethon. Io stesso avevo abbandonato questo tipo di studi per la mancanza di fondi. Quando è arrivato Telethon, assieme a Fulvio Mavilio abbiamo fatto un progetto, ci è stato finanziato e così siamo ripartiti. Senza Telethon, quindi, questi risultati non sarebbero arrivati. Certo, ci sono stati anche altri finanziatori aggiuntisi nel corso degli anni, come il Parent Project Italia, la Comunità Europea e più recentemente anche l'AFM (Association Française contre les Myopathies), resi necessari anche da una ricerca che in sé è molto costosa, sia in termini di fondi che di lavoro umano. E tuttavia, in tale contesto, è giusto ribadire che Telethon è stata la vera e propria "scintilla" (oltre che il principale finanziatore di tutti questi anni) che ha rimesso in moto la nostra ricerca.

Articolo tratto da DM 149/150 - gennaio 2004. DM è un trimestrale edito dalla Direzione Nazionale dell'Unione Italiana Lotta alla Distrofia Muscolare. La Redazione di DM ha sede in: Via P.P. Vergerio, 19 - 35126 Padova, Tel. (049) 8025248 - Fax (049) 8025249 e-mail: redazionedm@eosservice.com