Duchenne e Becker: approcci recenti
a cura di Angela Berardinelli
Gli esperimenti volti a manipolare l'espressione della distrofina e quelli mirati a inibire il proteasoma: presentiamo ai lettori alcuni recenti risultati in ambito di ricerca sulle distrofie di Duchenne e di Becker
La distrofina e il gene che codifica per essa sono stati individuati alla fine degli anni Ottanta, generando una comprensibile attesa per un'imminente terapia risolutiva riguardante sia la distrofia di Duchenne, nella quale la distrofina è assente, sia quella di Becker, in cui è ridotta o alterata.
Purtroppo, negli anni successivi, l'approfondimento delle conoscenze relative al gene, alle sue grandi dimensioni, alle possibili diverse anomalie che conducono alla malattia e ai numerosi splicing alternativi [lo splicing è il processo di rimozione degli introni del DNA, ovvero delle parti non codificanti, prima che l'RNA venga tradotto in proteina, N.d.R.] ha dimostrato grandi difficoltà ad ipotizzare una terapia risolutiva per queste malattie. E tuttavia, mentre molto si è fatto e si sta facendo per migliorare la gestione clinica dei pazienti, con visibili risultati anche relativamente alla durata della vita, sono in corso numerosi progetti di ricerca per individuare possibili strategie risolutive e per verificarne la loro applicabilità nell'uomo.
Tra questi ultimi affronteremo in questa sede gli esperimenti volti a manipolare l'espressione della distrofina e quelli mirati ad inibire il proteasoma, ovvero il tentativo di bloccare gli eventi conseguenti alla mancanza della distrofina, quali appunto i processi di degradazione cellulare.
Come manipolare la distrofina
Quale ulteriore premessa, è necessario anche ricordare i due modi con i quali attualmente si può modificare l'espressione del gene della distrofina.
Da una parte si può indurre specificamente il "salto" di alcuni esoni [le parti del DNA codificanti, N.d.R.], intervenendo sullo splicing (exon-skipping). Di tale strategia potrebbe beneficiare il 70-80% dei soggetti affetti da Duchenne. In ogni caso non tutte le delezioni (e quindi non tutti i soggetti) potrebbero avvantaggiarsene, ad esempio quando esse determinano l'alterazione di domìni funzionali cruciali della proteina oppure nel caso di delezioni enormi. Per la tecnica dell'exon-skipping vengono utilizzati gli oligonucleotidi antisenso.
Con l'altro modo, invece, si interviene sulla traduzione in presenza di agenti che sopprimano le cosiddette mutazioni nonsense. Quest'ultima strategia potrebbe essere di aiuto per circa il 15% dei pazienti, quelli appunto con tale tipo di mutazioni. È già stata per altro dimostrata una diversa suscettibilità alla risposta in relazione alle diverse mutazioni nonsense.
Gli oligonucleotidi antisenso (AOs)
Si tratta di composti di acidi nucleici sintetizzati chimicamente che possono essere creati in modo da interferire con siti coinvolti nello splicing. Mascherando cioè uno dei domìni cruciali del gene coinvolto nella definizione dell'esone e nello splicing, si arriva alla perdita dell'esone-bersaglio, in modo da escluderlo dall'mRNA maturo. Si può quindi modificare il normale processo di splicing con straordinaria specificità e in molti laboratori si è ormai dimostrato che sia in vitro sia in vivo si può indurre uno specifico exon-skipping nel gene della distrofina.
Va ricordato in ogni caso che non siamo in presenza di una terapia genica: infatti, pur manifestandosi l'effetto di queste sostanze nel nucleo e nel processo di trascrizione del gene, esso non modifica quest'ultimo in modo permanente. Il limite principale di tale metodo è proprio quindi la sua durata limitata e la necessità di iniezioni intramuscolari dirette per veicolare gli AOs.
Già in altre patologie - come alcune forme di cancro - si utilizzano gli oligonucleotidi antisenso. Essi hanno naturalmente una serie di effetti collaterali (a carico del rene, del fegato oppure attivando il sistema immunitario o la cascata della coagulazione), in parte dipendenti dalla dose in parte dalla loro composizione chimica. Nella maggior parte dei casi, comunque, si tratta di problemi non troppo pesanti e controllabili.
Trial su pazienti Duchenne
I trial su pazienti con distrofia di Duchenne sono volti, in questa fase, a stabilire la sicurezza e l'applicabilità della tecnica di exon-skipping e non a dare una risposta terapeutica effettiva, tenendo conto che difficilmente si potrà pensare di utilizzare iniezioni intramuscolari diffuse e ripetute per "risolvere" la malattia.
Nell'ottobre del 2004 a Naarden (Olanda), si è svolto un meeting cui hanno partecipato genitori di pazienti, clinici, ricercatori e rappresentanti di industrie farmaceutiche, allo scopo di definire i protocolli di sperimentazione. Per l'occasione vennero discussi e confrontati due protocolli per l'uso degli AOs, uno del gruppo inglese, diretto da Francesco Muntoni (Londra) e uno del gruppo olandese-belga, diretto da Gert van Ommen (Leiden).
Il protocollo inglese è rivolto a ragazzi tra i 14 e i 18 anni di età, con delezioni che possano essere "riparate" dallo skipping degli esoni 51 e 53. Esso prevede una valutazione mediante risonanza magnetica dei muscoli distali, per valutarne il grado di compromissione/risparmio e decidere la sede di inoculo. Saranno a tal proposito individuati tre gruppi di pazienti, che riceveranno diverse dosi di AOs. Tutti i soggetti verranno sottoposti a biopsia dopo un mese.
Per quanto concerne invece il protocollo olandese-belga, che include pazienti fra gli 8 e i 16 anni, questi ultimi dovranno essere sottoposti ad una prima biopsia muscolare, dalla quale si ricaveranno cellule su cui verificare in laboratorio l'efficacia dell'applicazione degli AOs che verranno poi somministrati nei casi che abbiano dimostrato una risposta positiva. Successivamente all'inoculo di AOs è prevista l'esecuzione di una nuova biopsia per la verifica dei risultati ottenuti.
In entrambi i casi, comunque, i soggetti verranno controllati attentamente per verificare l'eventuale comparsa di effetti collaterali.
Non disponiamo al momento di ulteriori informazioni rispetto a questi studi, ma va ribadito trattarsi non di trial terapeutici dai quali aspettarsi - ora - un miglioramento clinico evidente, bensì di studi preliminari, allo scopo di verificare la sicurezza e l'efficacia di questa tecnica.
Inibizione del proteasoma
Poco più di due anni fa il gruppo diretto a Genova da Carlo Minetti aveva dimostrato che nel muscolo diaframma e gastrocnemio del modello murino di Duchenne (topo mdx), la molecola MG-132 aveva il potere di bloccare la degradazione proteica, ripristinare l'espressione della distrofina e conseguentemente quella del complesso glicoproteico associato alla distrofina stessa (DAG).
Oggi la medesima équipe ha dimostrato l'efficacia di questa molecola anche in cellule coltivate da biopsie muscolari di pazienti affetti da distrofia di Duchenne e di Becker. Lo studio è stato condotto su biopsie provenienti da nove soggetti, sei dei quali con Duchenne e tre con Becker.
È noto infatti che l'assenza della distrofina determina, tra le altre conseguenze, un danno meccanico alla membrana muscolare e altera lo stato di altre proteine ad essa associate, rendendo molto più fragile la membrana rispetto alle sollecitazioni indotte dalla contrazione muscolare.
In sostanza, la molecola MG-132, un inibitore del proteasoma (cioè la struttura deputata alla degradazione proteica), aggiunta a colture di cellule provenienti da soggetti affetti da Duchenne e Becker, ha dimostrato un recupero di distrofina, che si trovava nella sede appropriata, e delle proteine ad essa associate.
Non tutte le colture provenienti da soggetti Duchenne, ma solo 4 su 6 (il 67%) di esse ha mostrato un chiaro recupero di distrofina e verosimilmente la risposta è diversa a seconda della mutazione. Molto buona invece la risposta nelle cellule provenienti dai soggetti affetti da Becker.
Isoforma della distrofina
Altro risultato importante dello studio genovese è che, insieme alla distrofina "completa" del peso molecolare di 427 Kda, si è verificata l'espressione anche dell'isoforma della distrofina dal peso di 260 Kda. Quest'ultima, che fino a pochi anni fa veniva ritenuta specifica della retina (sappiamo infatti che nella retina la distrofina è espressa e che la sua assenza nella Duchenne è correlata ad alterazioni elettrofisiologiche della stessa, quali l'assenza o la riduzione dell'onda b scotopica dell'elettroretinogramma, senza che tuttavia i pazienti lamentino sintomi visivi), è in realtà presente anche in molti altri tessuti, come il cervello, il rene e l'intestino - oltre che nel topo - e si è dimostrato che la sovraespressione di essa contribuisce a migliorare l'andamento della patologia.
Quindi, sebbene si tratti in questo caso solo di un esperimento condotto su cellule coltivate - pur di provenienza umana - i risultati ottenuti supportano l'opportunità di proseguire gli studi in questa direzione, con la possibilità, in futuro, di applicare tale tecnica all'uomo.