Distrofina: un gene modello
di Alessandra Ferlini*, Francesca Gualandi* e Paola Rimessi*
Dopo i buoni risultati degli anni scorsi, è stato avviato a Ferrara un nuovo progetto triennale, finanziato da Telethon, che studierà la distrofina e cercherà di acquisire informazioni utili a possibili terapie
Il Laboratorio di Genetica Molecolare della Sezione di Genetica Medica dell'Università di Ferrara è impegnato da anni nella diagnostica e nella ricerca sulle distrofinopatie che rappresentano un gruppo di patologie genetiche ereditarie legate al cromosoma X (colpiscono quindi prevalentemente individui di sesso maschile), dovute a mutazioni eterogenee nel gene distrofina.
Quest'ultimo è molto grande e complesso e le sue alterazioni sono alla base di quadri clinici variabili come quelli della distrofia di Duchenne o di Becker, della cardiomiopatia dilatativa legata al cromosoma X, fino a situazioni molto lievi o asintomatiche, spesso caratterizzate da aumento del CK sierico. Il gene distrofina contiene l'informazione necessaria alla produzione della proteina distrofina, componente fondamentale della struttura delle fibre muscolari scheletriche e cardiache.
Esoni e introni
La distrofina è formata da sequenze di DNA definite esoni e da altre chiamate introni. I primi sono in genere piccoli e danno origine direttamente alla proteina distrofina (sequenze codificanti). Gli introni, invece, sono molto più estesi e non partecipano direttamente a costituire la proteina (regioni non-codificanti).
La maggioranza degli studi sulle distrofinopatie si è focalizzata sull'analisi degli esoni, spiegando, nella maggior parte dei casi, la diversa gravità del danno muscolare sulla base del tipo di difetto a livello di DNA codificante. E tuttavia esistono pazienti che manifestano la malattia con gravità molto diversa, pur presentando lo stesso difetto nel DNA codificante (alterazioni negli stessi esoni).
Le ricerche attuate
Il nostro laboratorio ha ottenuto finanziamenti dall'Unione Europea (Progetto Finger) e da Telethon (Progetto GGPO2311), tramite i quali è stato possibile esplorare tre aspetti importanti delle distrofinopatie: l'esatta definizione della mutazione a livello del DNA, il profilo dell'RNA (ribotipo) in tessuti di pazienti e la presenza di RNA originati da regioni introniche.
Nell'ambito di tali progetti è stato inoltre condotto uno studio pilota per valutare in vitro la fattibilità della modulazione del messaggero del gene distrofina (cioè la molecola generata dal "DNA stampo" che viene in seguito processata e trasformata in "RNA messaggero") con oligonucleotidi antisenso (AOs). Questi ultimi sono molecole di RNA artificiali disegnate su specifiche regioni del gene sia normali che coinvolte in mutazioni, le quali consentono di correggere l'RNA messaggero mutato.
Tale tecnica ha delle potenzialità terapeutiche, laddove si siano identificati possibili "bersagli" a livello dell'RNA. I risultati ottenuti nell'ambito di questi due progetti hanno permesso di chiarire ad esempio il meccanismo patogenetico alla base di alcune forme di distrofinopatia e/o di mettere a punto la correzione in vitro del difetto responsabile della mancata produzione della proteina distrofina in alcuni specifici casi.
L'analisi del DNA e dell'RNA in pazienti selezionati ha permesso altresì di capire che la gravità della sintomatologia derivava da un'alterazione nel funzionamento di specifiche sequenze introniche nel gene distrofina. L'identificazione di tali sequenze e del meccanismo patogenetico che sta alla base del grave interessamento muscolare rappresenta il prerequisito per ulteriori studi volti a dimostrarne il ruolo funzionale in sistemi sperimentali ed eventualmente a modularne l'attività per ripristinare una funzione corretta del gene distrofina.
Nuovo finanziamento Telethon
I risultati ottenuti - grazie anche alla preziosa collaborazione di pazienti affetti da distrofinopatie - ci hanno consentito di ottenere un finanziamento Telethon per un nuovo progetto triennale (GGPO5115), che si avvarrà di un'ampia serie di pazienti. Due gli obiettivi fondamentali.
Il primo punta a caratterizzare estensivamente le sequenze introniche trascritte del gene distrofina (RNA non-codificanti - ncRNA), valutandone le caratteristiche strutturali e indagandone la presenza di motivi regolativi. Tali ncRNA potenzialmente funzionali verranno indagati per il profilo di espressione e per la presenza di mutazioni, in pazienti selezionati. Questo approccio ha la finalità di ampliare il numero di pazienti con distrofinopatia di cui sia nota la mutazione causativa, ma anche le sequenze geniche possibile bersaglio di approcci terapeutici.
Il secondo obiettivo è quello invece di modulare il processo di splicing (la rimozione degli introni del DNA) mediante RNA antisenso in cellule stabilizzate da tessuti di pazienti (cellule muscolari o della cute indotte a differenziare in senso miogenico). Tale approccio verrà utilizzato per numerose mutazioni causa di fenotipo clinico severo che possono essere indotte ad un comportamento di splicing più favorevole e associato ad un fenotipo cellulare più lieve.
Parte del progetto sarà inoltre costituita dalla messa a punto di un sistema di prescreening in vitro che ci consenta di validare l'efficacia dell'oligonucleotide antisenso. Quest'ultimo verrà poi utilizzato sempre in vitro, ma per modulare le mutazioni distrofina su cellule dei pazienti.
Ci si propone infine di testare anche l'efficacia di nuovi sistemi per veicolare le molecole RNA antisenso all'interno delle cellule bersaglio. Tali sistemi si basano sull'utilizzo di nanosfere polimeriche proposte per la somministrazione di sostanze a scopo vaccinale.
Grandi aspettative
Ci attendiamo a questo punto che il nuovo progetto consenta sia di aumentare l'individuazione di mutazioni atipiche del gene distrofina (che interessano regioni non codificanti), sia di valutare la presenza di RNA trascritti a partire dagli introni con possibili funzioni regolative sul fenotipo, sia di testare l'applicabilità della modulazione dell'RNA con oligonucleotidi antisenso in mutazioni paziente-specifiche, ma anche in modo esone-specifico, per poter modulare virtualmente la maggior parte degli esoni della distrofina.
Pur trattandosi di un approccio in vitro, speriamo quindi di ottenere informazioni rilevanti per una possibile futura applicazione terapeutica.
Non resta a questo punto che ringraziare Telethon Italia, l'Unione Europea e la Fondazione Legato Ferrari per i finanziamenti che hanno finora consentito di procedere alle nostre ricerche.
*Laboratorio di Genetica Molecolare, Sezione di Genetica Medica, Università di Ferrara.