Incontriamo la ricerca Telethon

a cura di Moreno Bagarello

Quest'anno le XXXV Manifestazioni Nazionali UILDM di Palermo rappresentavano un'occasione particolarmente ghiotta per l'informazione medica di pazienti e familiari. Sei titolari di progetti finanziati da Telethon (Cossu, Minetti, Pegoraro, Trevisan, Vita e Zara, coordinati da Niccolò Contucci) hanno infatti accettato l'invito, per riferire su alcuni recenti avanzamenti che aprono nuovi scenari nella lotta alle malattie neuromuscolari.

Pubblichiamo in questo numero la prima parte del resoconto su tale appuntamento.

Strategia ex vivo per la terapia delle miopatie è il titolo dell'intervento con cui Giulio Cossu (Università di Roma) ha aperto, a Palermo, il convegno Incontriamo la ricerca Telethon.

La terapia genica è una nuova disciplina biomedica, nata una decina di anni fa negli Stati Uniti, che studia le possibilità di trasferire, a scopo terapeutico, una copia sana del gene malato all'interno delle cellule dei pazienti affetti da malattie genetiche. Essa può avere un approccio in vivo, in cui si introduce nell'organismo il gene (porzione di DNA contenente l'informazione per fare una proteina), come fosse un farmaco, ad esempio iniettandolo in circolo o sotto la cute. La difficoltà è di raggiungere proprio le cellule che interessano, inserire il gene nel patrimonio genetico del paziente e fargli produrre la proteina deficitaria. Nell'ex vivo si prelevano invece delle cellule dal paziente, le si cresce e le si tratta in laboratorio (dove è più facile trasferirvi il gene), per poi reinserirle nell'organismo, evitando così la risposta immune, poiché esse appartengono al soggetto stesso. Quest'ultimo metodo funziona bene con le cellule del sangue, disponibili con un semplice prelievo e reinseribili con un'iniezione endovena, mentre è problematico in altri tessuti, come il fegato, il muscolo scheletrico o il sistema nervoso.

Per trasferire il gene isolato in laboratorio, il mezzo più efficiente è rappresentato dai virus, che fin dagli albori dell'evoluzione hanno un'estrema capacità di penetrare nelle cellule e possono essere manipolati in modo da contenere un gene terapeutico e trasferirlo nel nucleo cellulare senza produrre infezioni.

Lavorando sulle cellule dette "satelliti", per la loro particolare posizione intorno alla fibra muscolare, e usando un gene reporter che produce una colorazione blu, si è dimostrato di potervi trasferire con efficienza dei geni: tali cellule però sono poche (a maggior ragione in caso di miopatia) e con scarsa capacità di sviluppo in coltura.

Per altra via si può sfruttare la cosiddetta "conversione miogenica", per la quale cellule di altre strutture possono trasformarsi in muscolo (il fenomeno è stato originariamente osservato nella fase fetale o perinatale). Si è infatti potuto dimostrare che, facendo interagire in laboratorio cellule muscolari già formate con altre di derma trattate adeguatamente, queste ultime - riconoscibili dalla solita colorazione blu precedentemente indotta artificialmente - possono dare luogo a fibre muscolari perfettamente formate e capaci di costituire in coltura dei sarcomeri (le strutture contrattili), di contattare un terminale nervoso per creare una sinapsi (cioè la giunzione neuromuscolare) e di esprimere tutti i geni propri del muscolo.

Queste cellule di derma trattate in laboratorio producono fibre muscolari anche dopo essere state iniettate in modelli animali e anche quando si utilizzino cellule umane, che riescono così a dar luogo nell'animale ad un prodotto genico tipico del muscolo dell'uomo. Questo sistema ha il vantaggio della facile reperibilità delle cellule di derma (con una biopsia che è poco più di un'iniezione), che sono poi isolabili in numero elevatissimo in coltura per inserirvi il gene terapeutico e trattarle in modo che si trasformino in cellule di muscolo. Però esse non possono raggiungere i tessuti malati attraverso la circolazione e, considerando che la loro capacità di diffondere dal sito di ingresso non supera i due-tre millimetri, richiederebbero una quantità di iniezioni per singolo muscolo clinicamente improponibile.

Una soluzione sembra suggerirla la recente scoperta che anche le cellule del midollo possono diventare muscolo. Una volta marcate infatti le cellule midollari di un topo donatore, se ne è dimostrata poi la presenza nelle fibre in fase di rigenerazione di un muscolo tibiale danneggiato ad hoc in un topo ricevente. Esse devono necessariamente aver raggiunto il muscolo in questione attraverso la circolazione sanguigna, anche se non in numero elevatissimo. Va però considerato che dovevano competere con le cellule muscolari endogene del topo ricevente, che non è miopatico.

Si stanno ora conducendo studi per capire con precisione quale frazione del midollo sia implicata in questi processi, se la si possa espiantare in coltura, trasferirvi il gene sano e reinserirla per via circolatoria, e se tutto ciò infine possa comportare dei benefici per pazienti affetti da malattia neuromuscolare.

Carlo Minetti e Federico Zara (rispettivamente Università e Ospedali Galliera di Genova) hanno riferito della recente identificazione del gene della caveolina-3.

Le caveolae sono una sorta di piccole cavità, formate principalmente da un tipo di proteina chiamato caveolina, osservabili al microscopio elettronico e presenti nella membrana cellulare di diversi tessuti. La caveolina-3, in particolare, è la proteina che aggregandosi in un complesso di proteine tutte uguali (polimero) forma la struttura "a rete" delle caveolae presenti nelle fibre muscolari. Queste ultime sembrano essere coinvolte nel trasporto di proteine dall'esterno all'interno delle cellule muscolari e nella produzione di energia. Diversamente quindi dalla distrofina o dai sarcoglicani, che sembrano avere una funzione meccanica, il ruolo della caveolina sembra essere di tipo biochimico. Molti aspetti rimangono da approfondire, tra cui l'interazione con la stessa distrofina e con altre importanti proteine del muscolo.

Alterazioni della caveolina-3 sono state osservate in pazienti affetti da una forma di distrofia di tipo dominante che interessa sia i bambini che gli adulti e che colpisce prevalentemente i cingoli, le braccia e le gambe. Questa distrofia, pur non essendo tra le forme più serie, in genere impedisce di alzarsi autonomamente dopo i quarant'anni. Altri segni sono una marcata pseudoipertrofia del polpaccio, l'aumento dei valori di CPK (fino a 25 volte oltre la norma), oltre che sintomi iniziali di debolezza e di dolori muscolari dopo sforzo.

Per isolare e identificare il gene della caveolina-3 umana, fondamentale è stata la grande omologia con i geni che codificano per l'analoga proteina nel topo e nel ratto. Esso ha sede nel cromosoma 3 ed è costituito da due sezioni (esoni). Le mutazioni sembrano interessare il dominio che permette alla proteina di legarsi alla membrana cellulare e quello che fa interagire tra loro le caveoline.

La scoperta permetterà d'ora in avanti diagnosi più precise di questa patologia e ricerche più mirate di specifiche terapie.

Nella sua relazione, Elena Pegoraro (Università di Padova) ha trattato lo stato di portatrici X-linked di distrofia muscolare di Duchenne.

E' noto che la maggior parte delle portatrici di tale patologia è asintomatica (a parte talora una modesta alterazione della CK e una lieve ipertrofia dei polpacci), mentre una ristretta percentuale - circa il 10% - presenta segni clinici di malattia, talora severi come quelli di un maschio affetto (portatrici manifeste).

La biopsia muscolare di una portatrice è caratterizzata dalla coesistenza (mosaico) di fibre distrofino-positive (gene per la distrofina normale) e distrofino-negative (gene per la distrofina mutato). Nelle portatrici manifeste il numero di fibre distrofino-positive è estremamente ridotto, mentre in quelle asintomatiche, le fibre distrofino-positive prevalgono nettamente sulle poche fibrette distrofino-negative.

Il fenomeno dell'inattivazione del cromosoma X è la causa di questo aspetto a mosaico di fibre distrofino-positive e negative, nel muscolo delle portatrici. In una donna, in una fase precoce dello sviluppo embrionario, ciascuna delle cellule inattiva casualmente o il cromosoma X di origine paterna o quello di origine materna. Risultato di questa inattivazione è che in una femmina adulta normale circa il 50% delle cellule ha attivo il cromosoma X di origine paterna e circa il 50% il cromosoma X materno. In rare donne l'inattivazione del cromosoma X è "sbilanciata". Viene cioè inattivato quasi totalmente un solo cromosoma X. Questo fenomeno non ha rilevanza clinica in un soggetto normale, dove entrambi i cromosomi X sono "sani", ma se una paziente ha una mutazione per il gene della distrofina in uno dei suoi due cromosomi X, e ad inattivarsi è il cromosoma X normale, allora la paziente si troverà nelle condizioni di un maschio affetto (tutte le cellule con il gene per la distrofina mutato) e mostrerà segni clinici di miopatia.

Tramite metodiche complesse, siamo oggi in grado di studiare il fenomeno dell'inattivazione del cromosoma X e di riconoscerne l'origine paterna o materna. Sorprendentemente, nel 90% delle portatrici manifeste, il cromosoma X con il gene per la distrofina mutato è di origine paterna e deriva da mutazioni di un singolo spermatozoo. Questo fatto ha importanti conseguenze per la consulenza genetica, poiché in una famiglia con provata origine paterna del gene per la distrofina mutato, il rischio di ricorrenza in un figlio maschio è nullo (i maschi ricevono dal padre solo il cromosoma Y), mentre il rischio di ricorrenza in una figlia femmina è praticamente pari all'incidenza di nuove mutazioni.

Nel tentativo di comprendere perché in una portatrice sana ci siano molte più fibre distrofino-positive che negative, si è studiato nel muscolo il fenomeno della "normalizzazione biochimica", ovvero della diffusione di distrofina da una zona del muscolo distrofino-positiva ad una originariamente distrofino-negativa. Conseguenza di questo fenomeno è il progressivo divenire del muscolo più "distrofino-positivo".

Nelle portatrici manifeste (con segni clinici di malattia muscolare) avviene invece un fenomeno diverso. In questa categoria di pazienti il numero di fibre distrofino-negative è nettamente superiore a quello delle fibre distrofino-positive e di conseguenza la distrofina è troppo poca per ripopolare le zone distrofino-negative. Quello che accade in questa categoria di portatrici è il fenomeno della "normalizzazione genetica". Le zone distrofino-negative sono soggette a una degenerazione che attiva le cellule satellite del muscolo, responsabili della rigenerazione muscolare. In una portatrice anche le cellule satellite saranno distrofino-positive o negative. Se la cellula satellite attivata è distrofino-positiva, la neo-formata membrana muscolare sarà sana e stabile, se la cellula satellite attivata è distrofino-negativa, allora la membrana sarà destinata a nuovi cicli di degenerazione-rigenerazione. Nel tempo, quindi, il muscolo tenderà ad avere sempre più nuclei distrofino-positivi.

In conclusione, alla luce di quanto detto, le portatrici di distrofia di Duchenne rappresentano un modello ideale di terapia genica in vivo, e un interessante modello sperimentale per studiare il destino dell'introduzione di distrofina in un muscolo distrofino-negativo.

(1-continua)

Articolo tratto da DM 131 (agosto 1998) - DM è il periodico dell'Unione Italiana Lotta alla Distrofia Muscolare Direzione Nazionale. Ha sede in Via P.P. Vergerio 19 - 35126 Padova. Tel. (049) 8025248 - Fax (049) 8025249. E-mail redazionedm@eosservice.com